Smart diagnostic microbiology

พญ. พิณทิพย์ สุชาติลิขิตวงศ์
กุมารแพทย์โรคติดเชื้อ ภาควิชาจุลชีววิทยา
คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

สรุปเนื้อหางานประชุม 9^th Ped ID Chula 2025 ในวันที่ 24 พฤษภาคม 2568

ปัจจุบันเทคโนโลยีการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการที่ทันสมัยมีส่วนสำคัญในการช่วยวินิจฉัยโรคติดเชื้อ ทำให้สามารถระบุเชื้อที่เป็นสาเหตุก่อโรคและผลทดสอบความไวต่อยาได้อย่างถูกต้องและรวดเร็ว อย่างไรก็ตามการแปลผลการตรวจทางห้องปฏิบัติการยังต้องอาศัยบริบททางคลินิกของผู้ป่วยมาใช้ประกอบการวินิจฉัยและการดูแลรักษาเสมอ

การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการเพื่อระบุเชื้อ

ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ในประเทศไทย อาศัยการระบุเชื้อด้วยวิธี conventional identification กล่าวคือใช้ลักษณะทางฟีโนไทป์ของเชื้อในการระบุเชื้อ เช่น การติดสีแกรมและรูปร่างเชื้อภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ลักษณะโคโลนีบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะ (selective media), สิ่งแวดล้อมและสารอาหารที่ใช้ในการเจริญเติบโต ผลการทดสอบทางชีวเคมีและเอนไซม์ (biochemical and enzymatic reactions) เพื่อดูคุณสมบัติเชื้อในการทำปฏิกิริยากับสารที่ใช้ทดสอบ เป็นต้น ในอดีตการระบุเชื้อแต่ละชนิดต้องนำหลอดที่บรรจุสารชีวเคมีเฉพาะชนิดจำนวนหลาย ๆ หลอดมาใช้ในการทดสอบ ซึ่งมีความซับซ้อนและใช้เวลาทดสอบนาน ทำให้เกิดการพัฒนาเครื่องอัตโนมัติสำหรับการตรวจวิเคราะห์เชื้อ (automated identification systems) โดยอาศัยเทคโนโลยีในการผลิตช่องทดสอบขนาดเล็กที่บรรจุสารชีวเคมีชนิดต่าง ๆ ลงในหลุมของ cards หรือ plates ระบบของเครื่องจะวิเคราะห์ผลทดสอบและระบุชนิดเชื้อด้วยซอฟต์แวร์ภายในระยะเวลาไม่กี่ชั่วโมง ทำให้เครื่องมือนี้ได้รับความนิยมและใช้อย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการทั่วไปในปัจจุบัน ตัวอย่างเครื่องอัตโนมัติสำหรับการตรวจวิเคราะห์เชื้อที่ได้รับการยอมรับ เช่น Sensititre ARIS 2X, bioMerieux VITEK2, BD Phoenix, Siemens MicroScan เป็นต้น

นอกจากนี้ยังมีการพัฒนาเทคโนโลยี Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ซึ่งได้รับความนิยมเพิ่มมากขึ้นเรื่อย ๆ ในห้องปฏิบัติการขนาดใหญ่ เป็นเทคนิคที่ใช้เลเซอร์กระตุ้นโมเลกุล ribosomal proteins ของเชื้อให้ระเหิดออก จากนั้นจึงวัดมวลต่อประจุ (mass-to-charge ratio) ของโมเลกุลดังกล่าวด้วยระบบ time-of-flight mass spectrometry เพื่อสร้างลายพิมพ์โปรตีนเฉพาะของเชื้อแต่ละชนิด ทำให้ระบุเชื้อได้ภายในระยะเวลาไม่กี่นาที ตัวอย่าง MALDI-TOF MS ที่ได้รับการยอมรับ เช่น Bruker MALDI Biotyper, bioMerieux VITEK MS เป็นต้น

การทดสอบความไวของเชื้อต่อยาในห้องปฏิบัติการ

จุดประสงค์ของการทดสอบคือใช้ตรวจหา acquired resistance ของเชื้อต่อยาต้านจุลชีพชนิดต่าง ๆ ซึ่งถ้าเชื้อมีการดื้อยาชนิดหนึ่ง ๆ ยาชนิดนั้นอาจไม่มีประสิทธิภาพในการนำมารักษาผู้ป่วย การทดสอบความไวต่อยามี 2 วิธีหลักคือ

Dilution methods ประกอบด้วยวิธี broth dilution ซึ่งเป็นวิธีอ้างอิงสำหรับเชื้อ aerobes และวิธี agar dilution ซึ่งเป็นวิธีอ้างอิงสำหรับเชื้อ anaerobes ทั้งสองวิธีนี้ให้ผลทดสอบเป็นค่า minimal inhibitory concentration (MIC) ซึ่งหมายถึงค่าความเข้มข้นของยาที่น้อยที่สุดที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อได้โดยอ่านผลด้วยตาเปล่าหรือใช้เครื่องอัตโนมัติ
Diffusion methods ประกอบด้วยวิธี disk diffusion (Kirby‐Bauer) วัดผลทดสอบเป็นขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของ circular inhibition zone ของยาต้านจุลชีพแต่ละชนิด และวิธี gradient diffusion เช่น bioMerieux Etest ให้ผลทดสอบเป็นค่า MIC โดยอ่านค่าตัวเลขความเข้มข้นยาบนแผ่น strip ที่อยู่ตรงกับจุดตัดขอบล่างของ elliptical inhibition zone

ค่า MIC หรือ zone diameter ที่ได้จะถูกนำมาแปลผลตาม breakpoint และ interpretive category ซึ่งปัจจุบันนิยมใช้ เกณฑ์อ้างอิงระดับสากลซึ่งจัดทำและเผยแพร่โดย Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) หรือ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)

กรณีศึกษาที่ 1 เด็กหญิงอายุ 9 ปี มาด้วยอาการเจ็บคอและผื่น

ข้อมูลผู้ป่วย เริ่มมีอาการเจ็บคอ ทอนซิลมีจุดหนอง ไข้ คลื่นไส้อาเจียน มาประมาณ 3 วัน จากนั้นมีผื่นแดงกระจายทั่วตัวเหมือนกระดาษทราย ลิ้นมีลักษณะคล้ายผลสตรอว์เบอร์รี่

การวินิจฉัย scarlet fever

การตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อยืนยันการติดเชื้อ Streptococcus pyogenes throat swab for rapid S. pyogenes antigen test VS. aerobic culture เนื่องจากความไวของการทดสอบขึ้นอยู่กับคุณภาพของตัวอย่างและประสบการณ์ของผู้ทำการทดสอบ ควรป้ายตัวอย่างบริเวณทอนซิลทั้งสองข้างและผนังคอด้านหลัง เก็บตัวอย่างด้วยไม้ป้าย 2 อัน หากผลทดสอบ rapid antigen test เป็นลบ ควรส่งไม้ป้ายอันที่สองไปเพาะหาเชื้อ S. pyogenes ซึ่งวิธีการเพาะเชื้อมีความไวในการทดสอบสูงกว่า rapid antigen test (sensitivity 75 – 85% VS. >90%) การทดสอบทางชีวเคมีที่นำมาใช้ระบุเชื้อ S. pyogenes ได้แก่ bacitracin susceptibility, PYR test, latex agglutination test for Lancefield group A identification

ผลการทดสอบ throat swab culture ในผู้ป่วยรายนี้ ดังแสดงในรูปที่ 1 พบเชื้อ S. pyogenes ที่มีการดื้อยาต้านจุลชีพหลายขนาน ซึ่งรวมถึง penicillin และ ampicillinรูปที่ 1 throat swab culture ของกรณีศึกษาที่ 1

อภิปราย penicillin และ ampicillin เป็นยาหลักที่ใช้ในการรักษาการติดเชื้อจาก β-hemolytic streptococci โดยทั่วไปการทดสอบความไวต่อยา penicillins และยากลุ่ม β-lactams อื่น ๆ ไม่จำเป็นต้องทำเป็นประจำ เนื่องจากเชื้อ β-hemolytic streptococci ที่ไม่ไวต่อยาในกลุ่มนี้พบได้น้อยมากและยังไม่เคยมีรายงานการดื้อยาในกรณีของ S. pyogenes เช่นเดียวกัน ดังนั้นถ้าพบ β-hemolytic streptococci ที่ไม่ไวต่อยา ควรตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเชื้อ (purity check) ทำการระบุชนิดใหม่ (re-identify) ทดสอบซ้ำ (retest) และหากผลยืนยันว่าถูกต้อง ควรส่งต่อเชื้อดังกล่าวไปยัง public health laboratory เพื่อวิเคราะห์เพิ่มเติม ในผู้ป่วยรายนี้ไม่ได้ทำการทดสอบเพื่อระบุชนิดใหม่ เนื่องจากห้องปฏิบัติการไม่ได้เก็บรักษาเชื้อไว้ (isolate storage) ทั้งนี้ CLSI ได้แนะนำให้ห้องปฏิบัติการเก็บรักษาเชื้อไว้เป็นระยะเวลาอย่างน้อย 7 – 14 วันหลังจากรายงานผลทดสอบแล้ว ผู้บรรยายจึงตั้งสมมติฐานว่าอาจเกิดจากการระบุชนิดของเชื้อผิดพลาด โดยเชื้อในกลุ่ม Streptococcus anginosus group เช่น S. constellatus โคโลนีเชื้อมีลักษณะ β-hemolytic และให้ผลบวก Lancefield group A ได้ จึงอาจทำให้ระบุชนิดเชื้อคลาดเคลื่อนเป็น S. pyogenes ได้

กรณีศึกษาที่ 2 เด็กหญิงอายุ 13 ปี มาด้วยอาการไข้และปวดเข่าซ้าย

ข้อมูลผู้ป่วย มีอาการไข้ polyuria, polydipsia คลื่นไส้อาเจียน ท้องเสีย มาประมาณ 5 วัน จากนั้นมีอาการปวด บวม แดง ร้อน กดและขยับเจ็บบริเวณข้อเข่าซ้ายแบบเฉียบพลัน ได้รับการเจาะเลือดและน้ำในข้อเข่าซ้ายส่งเพาะเชื้อ และให้ยา meropenem 2 gram IV q 8 hours ตามผลทดสอบความไวยาจาก รพ. แห่งแรก ก่อนส่งตัวมารักษาต่อที่ รพ. แห่งที่สอง

การวินิจฉัย melioidosis with septic arthritis, 1^st diagnosis of diabetes mellitus type 2 with simple hyperglycemia

การตรวจทางห้องปฏิบัติการ hemoculture และ synovial fluid culture ในผู้ป่วยรายนี้พบเชื้อ Burkholderia pseudomallei ผลการทดสอบความไวต่อยาด้วยวิธี disk diffusion จาก รพ. แห่งแรก พบว่า resistant ต่อยา trimethoprim/sulfamethoxazole (TMP/SMX), intermediate ต่อยา ceftazidime, และ susceptible ต่อยา imipenem ผลการทดสอบความไวต่อยาด้วยวิธี Etest จาก รพ. แห่งที่สอง พบว่าเชื้อไวต่อยาทุกชนิด ดังแสดงในรูปที่ 2รูปที่ 2 ผลทดสอบความไวต่อยาของเชื้อ Burkholderia pseudomallei ด้วยวิธี disk diffusion (ซ้าย) เปรียบเทียบกับ Etest (ขวา) ในกรณีศึกษาที่ 2

อภิปราย วิธีทดสอบและ breakpoints ที่ใช้สำหรับแปลผลความไวยาของเชื้อ B. pseudomallei โดยใช้เกณฑ์ของ CLSI และ EUCAST มีความแตกต่างกันค่อนข้างมาก (ตารางที่ 1) การศึกษา B. pseudomallei isolates ที่รวบรวมในอดีตพบว่า อัตราการดื้อยา TMP/SMX มีความแตกต่างกันระหว่างวิธี Etest (13%) และ disk diffusion (71%) เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน broth microdilutionโดย isolates จำนวนมากที่ดื้อยาด้วย disk diffusion กลับไม่ได้ดื้อยาด้วย Etest ปัญหาที่พบคือ inhibition zone ของ TMP/SMX มักจะไม่ชัดเจน (vague) ทำให้เกิดการแปลผลดื้อยาเกินจริง (overcall resistance) ในประเทศไทย B. pseudomallei ส่วนใหญ่ (99.7%) ยังคงมีความไวต่อ TMP/SMX

ตารางที่ 1 เปรียบเทียบวิธีทดสอบและ breakpoints การทดสอบความไวยาของเชื้อ B. pseudomallei โดยใช้เกณฑ์ของ CLSI และ EUCAST

แพทย์ไม่ควรเปลี่ยนสูตรยารักษาโดยอ้างอิงผล ‘I’ จากรายงานทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ disc diffusion ตามเกณฑ์ EUCAST เนื่องจากขนาดยา ceftazidime และ TMP/SMX ที่ใช้ในการรักษา melioidosis สูงกว่าขนาดยาปกติทั่วไป ซึ่งสอดคล้องกับแนวคิด ‘I’ ของ EUCAST ที่หมายถึง susceptible, increased exposure กล่าวคือ มีโอกาสสำเร็จในการรักษาเนื่องจากผู้ป่วยได้รับยาในขนาดที่สูงขึ้น ในขณะที่ยา meropenem ควรสำรองไว้ใช้สำหรับผู้ป่วย sepsis, ต้องรักษาใน ICU หรือไม่ตอบสนองต่อ ceftazidime นอกจากนี้ TMP/SMX ควรใช้รักษาในระยะ eradication phase แม้รายงานผลทดสอบเป็น ‘I’ และไม่ควรรายงานผลเป็น ‘R’ (resistant) โดยอ้างอิงจาก disc diffusion เพียงอย่างเดียว แต่แนะนำให้ทดสอบเพิ่มเติมเพื่อหาค่า MIC ของยา TMP/SMX และรายงานเป็น ‘R’ ก็ต่อเมื่อ MIC มากกว่า >4/76 µg/mL

เอกสารอ้างอิง

Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 34th ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2024.
The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 14.0, 2024.
Wuthiekanun V, Cheng AC, Chierakul W, et al. Trimethoprim/sulfamethoxazole resistance in clinical isolates of Burkholderia pseudomallei. J Antimicrob Chemother. 2005;55(6):1029-31.
Karatuna O., Dance DAB., Matuschek E., et al. Burkholderia pseudomallei multi-centre study to establish EUCAST MIC and zone diameter distributions and epidemiological cut-off values. Clin Microbiol Infect. 2021;27(5):736-741.
Dance DAB., Wuthiekanun V., Baird RW, et al. Interpreting Burkholderia pseudomallei disc diffusion susceptibility test results by the EUCAST method. Clin Microbiol Infect. 2021;27(6):827-829.